一代二代三代测序的基本原理及区别是啥啊?

illumina和pacbio的基本原理就是改造碱基,每个碱基加上不同颜色的发光基团。

测序的时候边合成边测序。和你的测序链ATGC配对完以后,配对合成好的碱基就把发光基团丢出去了,然后这个孔就会发出一个颜色的光,上面有个照相机不停地捕捉每个孔的光的颜色,就知道这个位置是什么碱基了。每条序列不停地被配对合成,碱基不断地丢出去发光基团,颜色连起来,就知道序列是什么样子了。

一代测序也叫Sanger(双脱氧链终止法):其利用了双脱氧核苷酸会终止PCR的原理。

优点:操作简单,结果清晰可靠。

缺点:通量低,时间久成本高。

二代测序技术(也称为高通量测序技术)

特点:将待测基因组片段打断成一些小的片段,然后再通过序列重叠区域的整合,从而实现一次性测大量的序列。

优点:通量高,准确性高,成本低,序列读取长度增加。

缺点:二代测序建库过程中有一个PCR富集的过程,一些序列没办法进行大量的扩增,从而造成了一些信息的丢失。

三代测序是对二代测序的一个升级。也可以一次性测大量的序列,而且不需要有PCR富集,但是单分子信号弱,错误随机会发生,可以靠覆盖度纠正,增加了测序的成本
 

一种测序方式。其利用了双脱氧核苷酸会终止PCR的原理。比如:一条序列为ATCGCTA,我们进行3次的双脱氧核苷酸,第一次加入双脱氧核苷酸A和正常的ATCG那么我们会得到下面两种序列,A、ATCGCTA。那么我们就知道碱基A在序列的第一个碱基和第7个碱基。同理运用双氧核苷酸T和C,就会得整个序列的对应碱基的位置BP信息。进而得到整条序列的ATCG的序列信息。当然这些都是由仪器进行检测的。

一代测序的特点:速度快,但是一次只能测一条单一的序列,且最长也就能测1000-1500bp。所以被广泛应用在单序列测序上。简单概括就是,一代测序只能测一条长度在1000bp左右的序列。

二代测序技术,也被称为高通量测序技术。它解决了一代测序只能测一条序列的缺陷。随着科研的不断深入,我们开始分析一个物种或样本中的所有序列信息,这个时候一代测序一次测一条的方式就无法满足我们的需求。二代测序技术就是在这样的情况下诞生的。之所以称其为高通量测序就是因为它一次能够同时测很多的序列。我们通过物理或是化学的方式将DNA随机打断成无数的小片段(250-300bp),之后通过建库(这里就不深入建库的原理了)富集了这些DNA片段。接下来将建完的库放入测序仪中测序,测序仪中有着可以让DNA片段附着的区域,每一个片段都有独立的附着区域,这样测序仪可以一次检测所有附着的DNA序列信息。最后通过生物信息学分析将小片段拼接成长片段。

二代测序特点:一次能够测大量的序列,但是片段被限制在了250-300bp,由于是通过序列的重叠区域进行拼接,所以有些序列可能被测了好多次。由于建库中利用了PCR富集序列,因此有一些量少的序列可能无法被大量扩增,造成一些信息的丢失,且PCR中有概率会引入错配碱基。所以三代测序就这样诞生了。

三代测序其实就是对二代测序的一个升级,简单来说就是它同样一次能测好多序列,但是测序的长度达到了10kb左右,并且不需要PCR富集序列,直接测序,这就解决了信息的丢失,以及碱基错配的问题。但目前来说三代测序依然有一定的缺陷:

三代测序技术依赖DNA聚合酶的活性,且成本很高,目前的错误率在15%-40%,极大地高于二代测序技术的错误率不过好在三代的错误是完全随机发生的,可以靠覆盖度来纠错(但这要增加测序成本)。

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